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傳統光動力治療（PDT）受限于II型光敏劑的氧依賴性機制（需持續O?供應生成單線態氧）、腫瘤細胞凋亡抵抗以及乏氧誘導的免疫抑制微環境，導致對缺氧實體瘤療效顯著降低。本研究通過硒摻雜-乙基修飾的分子工程策略，創新性地開發了一種近紅外生物光催化劑EBSe，EBSe對4T1細胞具有顯著的光毒性（>2500倍于亞甲藍MB）和優異的光毒性指數（PI, >32000）。EBSe表現出自適應的光動力過程，即在常氧下產生增強的I型/II型ROS，在乏氧時產生活潑的碳自由基。更重要的是，EBSe顯示出更高的細胞攝取，并經歷光誘導從溶酶體向細胞核轉移，以此激活鐵死亡、細胞焦亡和脹亡，這三種非凋亡途徑的協同作用增強了荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫效應。這項工作為開發強大的光敏劑（PSs）提供了一種可靠的策略，以克服實體腫瘤由于缺氧導致的凋亡抵抗和免疫抑制微環境。

圖1.（a) EBSe的設計策略及自適應光催化過程；(b) EBSe的作用機制及免疫激活過程

團隊的設計思路是對亞甲藍（MB）進行簡單修飾，利用硒取代提高光敏劑的系間穿越速率增強三重態量子產率，同時將甲基換成乙基提高光敏劑親脂性增強細胞攝取，希望通過兩種修飾協同作用提高MB的光動力性能。作者設計了四種光敏劑（MB、EB、MBSe 和 EBSe）并對其光物理/光化學特性進行了測試和系統性的構效關系研究。在甲醇中，EBSe的吸收和發射光譜（λ_ex = 662 nm，λ_em = 694 nm）相較于MB（λ_ex = 652 nm，λ_em = 680 nm）略有紅移。此外，EB與EBSe的摩爾消光系數明顯高于MB和MBSe，且具有良好的化學穩定性。EB和EBSe的LogP值明顯高于甲基取代衍生物MB和MBSe，這與EB和EBSe在PBS溶液中形成更多的H-二聚體的現象相一致。上述結果可能歸因于二乙胺基相較于二甲胺基具有更強的給電子能力及更高的親脂性。MBSe與EBSe的單線態氧量子產率分別達到85%和81%，遠高于MB（52%）和EB（57%）。這些結果主要歸因于重原子Se的引入提高了系間竄越（ISC）效率。此外，密度泛函理論（DFT）計算結果進一步顯示EBSe相比MB具有明顯更大的自旋軌道耦合（SOC）常數及更高的系間竄越速率。本研究還評估了四種光敏劑在PBS（pH = 7.4）溶液中的I型ROS生成能力，結果表明，EBSe在O₂^?- 和?OH的生成能力上均表現出最優異的性能。隨后，采用電子自旋共振（EPR）測量了各化合物光誘導的ROS生成能力。相較于MB、EB和MBSe，EBSe顯示出最高的活性氧EPR信號。同時，在常氧條件下，EBSe在PBS溶液中表現出最強的?OH信號，并伴隨有明顯的碳中心自由基信號，在缺氧條件下（氧濃度<1%，真空手套箱中），水溶液中碳自由基的EPR信號占據主導地位。值得注意的是，在缺氧條件下EBSe產生的碳自由基信號相對穩定，當溶液重新暴露于空氣中時，這些碳自由基能夠逐漸轉化為O₂^?-和?OH。此外，在近紅外（NIR）照射下，四種光敏劑均能夠光氧化NADH和四氫蝶呤（BH₄），其中EBSe表現出最高的氧化效率。

基于以上研究，團隊提出了EBSe（EBSe⁺）的光催化作用機制：在近紅外光激發下，EBSe從基態躍遷至單重激發態（¹EBSe^+*），¹EBSe^+*通過系間竄越到三重激發態（³EBSe^+*）。在常氧條件下，³EBSe^+*可以將能量轉移給周圍的氧分子生成單線態氧（¹O₂）。與此同時，由于EBSe比MB具有更高的親脂性并更易形成H-聚集體，使得³EBSe^+*能夠與基態分子EBSe⁺進行電子轉移生成EBSe^2+?和EBSe?，納秒和飛秒級瞬態吸收泵浦探測光譜也驗證了該類碳自由基的存在。在細胞環境中，³EBSe^+*可以從NADH等還原性生物分子中獲得電子，從而在無氧條件下產生EBSe?， EBSe?可進一步還原氧分子生成O₂^?-和?OH。循環伏安法顯示EBSe⁺/EBSe?的還原電位（-0.72 V vs NHE）比O₂/O₂^?-（-0.33 V vs NHE）和O₂/?OH（0.31 V vs NHE，pH = 7.0）更負。這些結果表明EBSe具有自適應光催化特性，在常氧和缺氧條件下均能產生具有細胞殺傷作用的ROS和碳自由基。

圖2.(a) 硒摻雜-乙基修飾的分子工程策略設計EBSe; (b)光催化過程；(c) 吸收/發射光譜；(d-f) ¹O₂、O₂^?-與?OH的檢測；（g-j）常氧或乏氧下各化合物產生ROS以及碳自由基的EPR圖譜；(K) 從乏氧到常氧環境下，碳自由基轉換成ROS的時間依賴圖；(l) 光催化NADH比較圖；(m) 各光敏劑循環伏安圖。

四種光敏劑（MB、EB、MBSe 和 EBSe）對4T1細胞均表現出極低的暗毒性（IC₅₀ > 512 μM），說明對MB進行的微小結構修飾保持了優異的生物安全性。在660 nm光照下，MB在常氧條件下表現出微弱光毒性（IC₅₀ = 9.2 μM），但在缺氧條件下光毒性顯著降低（IC₅₀ = 40.2 μM）。而EBSe在常氧（IC₅₀ = 0.014 μM）和缺氧條件下（IC₅₀ = 0.016 μM）均表現出極其優異的光毒性。與MB相比，EBSe在缺氧條件下對4T1細胞光毒性的提高超過了2500倍，對氧氣依賴性極低，且光毒性指數PI（即暗毒性與光毒性之比）在常氧條件下超過36000，在缺氧條件下超過32000。這些結果表明，引入硒原子或乙基這兩種修飾所產生的協同效應極大地提高了PDT性能。

為了深入探討EBSe顯著提升PDT性能的機制，團隊對4T1細胞中的光敏劑攝取情況以及其引起的細胞損傷進行了詳細研究。因具有更高的LogP值，乙基取代的EB和EBSe的細胞攝取效率顯著高于相應的甲基取代衍生物，且EBSe通過質子泵及胞吞作用進入細胞。通過共聚焦細胞實驗可知，EBSe在光照條件下以非氧依賴方式高效殺傷4T1細胞，而MB在缺氧條件下的殺傷效果則明顯降低。隨后，通過激光共聚焦熒光成像進一步研究了EBSe的亞細胞定位。在未進行光照前，EBSe主要富集在溶酶體（PCC=0.85），在光照處理后，EBSe與LysoTracker染色圖像的重疊度顯著降低（PCC=0.20），同時與Hoechst 33342細胞核的染色（PCC=0.72）顯著增加。這些結果表明，EBSe在光照下能夠嚴重損傷溶酶體，并轉移至細胞核，對核酸造成直接損傷。同樣地，MBSe、MB和EB在10分鐘光照處理后也出現了類似從溶酶體遷移至細胞核的現象。同時，EBSe在無氧條件下可直接有效地造成DNA損傷。綜上所述，EBSe在NIR光照下可引起溶酶體及細胞核的級聯損傷效應。

圖3.(a) EBSe在近紅外光誘導下從溶酶體向細胞核的遷移示意圖；(b) 細胞攝取效率；(c) 細胞內O₂^?-及ROS檢測共聚焦圖；(d) 活死細胞染色共聚焦圖；(e) 光誘導EBSe在細胞內遷移共聚焦圖；(f-g) 細胞器共定位圖及共定位系數；(h) 添加不同濃度的DNA片段后EBSe的吸收光譜; (i) 細胞中DNA損傷特征蛋白γ-H2AX水平的WB印跡分析；(j) 凝膠電泳檢測EBSe在光照射后對DNA的光氧化損傷。

為了進一步探索EBSe從溶酶體向細胞核遷移所引起的一系列效應，團隊選擇MB作為對照化合物進行了深入探索。研究發現，EBSe以較低濃度即可引起溶酶體膜通透性（LMP）增加，以及胞內H⁺與Fe²⁺顯著升高，同時胞內谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4，一種關鍵的鐵死亡抑制蛋白）和谷胱甘肽（GSH，胞內抗氧化劑）水平明顯下調。以上結果表明EBSe光誘導了細胞鐵死亡。同時焦亡抑制劑四乙基秋蘭姆二硫化物（TETD）也能部分恢復EBSe光照處理的細胞存活率，表明細胞也發生了焦亡途徑，即caspase-1及GSDMD表達下降，而GSDMD-N片段表達顯著增加。同時，EBSe⁺光照處理細胞的培養基上清液中IL-1β、IL-18細胞因子水平明顯升高，ATP和乳酸脫氫酶（LDH）釋放也顯著增加。此外，TEM及熒光成像發現，經EBSe⁺光照處理后的細胞表現出典型的腫脹死亡形態特征，包括線粒體及內質網腫脹、染色質異常凝聚和胞質空泡化。受損的內質網釋放鈣離子導致胞質鈣水平升高，光照處理后線粒體膜電位顯著下降，胞內ATP水平也顯著降低，表明線粒體功能受損、氧化磷酸化受到抑制。Western blot結果顯示，經EBSe光照處理后的細胞中，脹亡的標志性跨膜蛋白Porimin表達顯著上調，同時線粒體鈣蛋白酶1（calpain 1）也明顯激活，而促凋亡蛋白Bax則受到顯著抑制，導致Bcl-2/Bax比值升高，凋亡途徑受抑制。以上結果充分表明，EBSe產生的PDT效應能誘導腫瘤細胞發生鐵死亡、焦亡和脹亡多種非凋亡細胞死亡途徑，有效克服缺氧腫瘤的凋亡耐受性，并顯著激活針對腫瘤細胞的免疫反應。

圖4. (a) EBSe的PDT過程誘導多種細胞死亡途徑示意圖；(b-d) EBSe光誘導細胞發生鐵死亡相關驗證；(e-h) EBSe光誘導細胞發生焦亡相關驗證；(i-o) EBSe光誘導細胞發生脹亡相關驗證。

基于EBSe在體外PDT實驗中優異的抗癌細胞性能，團隊進一步在4T1荷瘤小鼠模型中評價了其體內抗腫瘤光療和協同免疫治療效果。首先，根據活體成像系統（IVIS）檢測了瘤內注射MB和EBSe的熒光信號變化，以確定給藥和光照時間。“EBSe+光照”組小鼠腫瘤體積明顯小于其他組，腫瘤抑制率（TGI）達到72.4%，而“MB+光照”組的TGI僅為34.0%，證明EBSe介導的PDT對于缺氧腫瘤的生長抑制更為有效。隨后，團隊在雙側皮下種植4T1腫瘤的小鼠模型中評價了EBSe和MB的光誘導腫瘤免疫治療效果。經過兩周光照治療后，EBSe組小鼠腫瘤體積顯著減少，其中原發瘤和遠端瘤的腫瘤抑制率分別達到68.2%和75.6%。相比之下，MB組對原發瘤和遠端瘤的腫瘤抑制率分別僅為38.2%和25.5%。流式細胞術分析顯示，EBSe處理組小鼠淋巴結中成熟樹突狀DCs細胞（CD11c/MHC II）比例達到40.19%，比MB組和PBS組分別提高了3.4倍和3.7倍；EBSe組中毒性T淋巴細胞（CD8⁺）細胞占比達10.44%，輔助性T細胞（CD4⁺）占比則從PBS組的7.89%提升至23.14%，MB組為13.17%。此外，小鼠血清炎癥因子檢測顯示，EBSe組促炎因子（TNF-α、IFN-γ和IL-6）表達升高，而抑制性因子IL-10則明顯下降。以上結果表明，EBSe可光消融缺氧腫瘤并激活系統免疫反應方面明顯優于MB，為缺氧腫瘤的治療提供了一種高效策略。

圖5.(a-b) 體內抗腫瘤PDT和免疫反應評估示意圖；(c) 治療和手術切除后原發性和遠端腫瘤的照片；(d-e) PDT治療期間和治療后原發性和遠端腫瘤的體積和重量；(f-g) PDT治療后不同組小鼠腫瘤和淋巴結中免疫指標流式細胞術檢測。

總之，本研究構建了一種非氧依賴型的光敏劑EBSe，EBSe可通過近紅外光照射誘導腫瘤細胞發生鐵死亡、焦亡和脹亡，有效激活針對乏氧腫瘤細胞的免疫反應。對亞甲藍（MB）進行簡單的硒取代和乙基化修飾，使EBSe具備了更高的三重態量子產率和親脂性，從而在缺氧條件下對4T1細胞表現出顯著增強的光毒性（提高>2500倍）以及極高的光毒性指數（PI>32000）。EBSe具有自適應光催化能力，即在常氧條件下能高效地產生Ⅰ型/Ⅱ型ROS，而在缺氧條件下產生碳自由基。此外，EBSe主要富集于溶酶體，并在光照作用下引發溶酶體功能障礙與膜通透性增加，隨后遷移至細胞核，造成DNA損傷。這些由PDT誘導的細胞器損傷激活了包括焦亡、鐵死亡及脹亡在內的多種非凋亡細胞死亡通路，協同誘發了4T1荷瘤小鼠強烈的抗腫瘤免疫反應。本研究為開發高性能、臨床轉化潛力的缺氧腫瘤光催化劑提供了可靠的策略，同時也為其他光催化領域的應用提供了重要的參考價值。

南京大學化學化工學院博士后姚善昆與博士研究生徐風梧為論文共同第一作者，指導老師為陳韻聰教授、何衛江教授和郭子建教授。作者特別感謝南京林業大學的劉志鵬教授與湖州師范學院的尚積禎教授，以及參與該工作的同學所提供的幫助。

郭子建，博士生導師，中國科學院院士，英國皇家化學會會士。現任南京大學化學和生物醫藥創新研究院院長，南京大學新生學院院長，南京大學學術委員會副主任，配位化學國家重點實驗室（南京大學）學委會副主任，國務院學位委員會學科評議組（化學）成員，教育部科技委員會委員化學化工學部委員，中國化學會常務理事。Chemical & Biomedical Imaging期刊創刊主編，曾擔任愛思唯爾Coord. Chem. Rev.副主編，中國化學會《無機化學學報》主編，以及Nat. Sci. Rev., Dalton Trans等國內外多家學術期刊編委或顧問編委等。曾主持多項國家自然科學基金重點項目，科技部973計劃重大科學前沿領域項目（首席科學家），國家自然科學基金委創新群體（學術帶頭人），得到國家基金委化學生物學領域首個重大研究計劃培育、集成及擇優項目的連續資助以及多項國家自然科學基金重點項目。曾獲教育部2015年度自然科學一等獎，意大利化學會2016年度Luigi Sacconi獎章，2020年度“亞洲生物無機化學學會杰出成就獎”等獎項。團隊長期從事化學生物學交叉領域研究，在生物無機傳感與成像示蹤、金屬抗腫瘤藥物的分子作用機制與靶向輸運及金屬免疫學等方面取得了系列創新性研究成果，已發表SCI論文480余篇，被引用2.9萬次，H指數84。

陳韻聰，教授，博士生導師。分別于2008年、2014年在南京大學化學化工學院獲得學士和博士學位，導師郭子建教授。2014年8月至2018年7月，香港科技大學唐本忠教授課題組從事博士后研究。2018年9月至2022年12月任南京大學化學化工學院副教授，2023年1月任教授。迄今已在Chem. Soc. Rev.; Nat. Commun.; J. Am. Chem. Soc.; Angew. Chem. Int. Ed.等雜志上發表SCI文章120余篇。文章總引用7500余次，單篇最高引用750余次，H-index 43, 獲授權發明專利6項。2021年獲國家自然科學基金委優秀青年進項目資助，曾獲得江蘇省優秀博士學位論文等榮譽，目前任Frontiers in Chemistry, Frontiers in Chemical Biology期刊副主編，Wiley旗下Luminescence期刊副主編，Chemical & Biomedical Imaging等期刊青年編委。

課題組主頁網址：

https://chem.nju.edu.cn/cyc/list.htm

https://chem.nju.edu.cn/gzj/list.htm